三代测序（单分子测序）
介绍
在2011年和2014年，PacBio和Oxford Nanopore Technologies，ONT公司分别发布了新型的单分子测序技术平台，这种突破性的测序技术被成为第三代测序技术。与前两代测序技术相比，其最大的特点就是单分子测序，测序过程无需进行PCR扩增，并且理论上可以测定无限长度的核酸序列。
技术原理
1. SMRT技术原理：边合成边测序。DNA聚合酶和模板结合，用4色荧光标记A、G、C、T这4种碱基（即是dNTP）。在碱基的配对阶段，不同的碱基加入，会发出不同的光，根据光的波长与峰值可判断进入的碱基类型。
2. 纳米孔技术原理(Oxford Nanopore)：纳米孔内共价结合分子接头。当DNA分子通过纳米孔时，它们使电荷发生变化，从而短暂地影响流过纳米孔的电流强度（每种碱基所影响的电流变化幅度是不同的），最后高灵敏度的电子设备检测到这些变化从而鉴定所通过的碱基。
PacBio SMRT优点
1. 无需PCR扩增，不会人为的引入突变；
2. 超长读长，平均读长可达到10Kb，最长读长可以达到40Kb；
3. 覆盖均匀，无GC偏好性；
4. 能直接测RNA分子和表观遗传修饰：比如DNA甲基化等3、甲基化分析；
PacBio SMRT缺点
1. 高错误率，每个碱基在10%-15%左右的错误率，但错误是随机错误。
2. 测序成本较贵。
PacBio技术应用
1. 基因组组装
利用PacBio测序平台，可以克服部分序列GC含量高或重复序列多等问题，更好的进行基因组详细描绘，从而进行精细的基因注释等研究。
PacBio测序平台不需要进行PCR扩增，因此可以减少基因组组装过程中的人为错误和偏差。
PacBio测序平台读长较长，因此相比二代测序拼接结果更为准确，同时可以利用其长片段来填补二代数据组装中产生的gap和连接contig为scaffold。
2. 全长转录组测序
利用PacBio测序平台读长较长的特点，进行转录组测序可以直接得到转录本的全长序列，省去了二代测序的拼接过程，使得过程更为简便，结果更为准确。
3. 甲基化分析
PacBio测序的技术原理可以直接检测到发生甲基化的核苷酸，因此可以在进行其它测序分析的同时完成DNA甲基化的分析。
纳米孔技术优点
1. 测序样本非常容易准备；
2. 读长超级长：在几百万bp长度，超过二代测序100万倍，也超过三代的PacBio测序(几万bp)；
3. 能直接测RNA分子和表观遗传修饰：比如DNA甲基化等；
4. 成本低廉：每次实验(run)大约150美元（～1000人民币）
5. 测序速度快：样本准备（～10分钟），测序（～40分钟）
纳米孔技术缺点
高错误率，每个碱基在10%-15%左右的错误率，这种错误是有偏好的(Biased)。
纳米孔技术的应用
临床应用：对于临床实践，实时获取和分析DNA/RNA序列很重要。Nanopore技术获得序列时间相比于其它平台要短得多，因此更加适合于临床环境，使得医生能够快速获得检测结果。比如，从临床样品准备到发现致病菌其只需要6小时，而完成胎儿非整倍体检查只需4小时。而这些在二代测序可能需要数天甚至数周时间。
