Nanopore测序技术是是基于电信号对碱基进行识别的的测序平台,该原理不同于Illumina和PacBio平台(基于荧光信号识别碱基)。因此Nanopore优点是测序时间短,通量大,读长更长。
测序平台
1. MinION:MinlON是Nanopore推出的第一款测序仪产品,也是目前该公司测序平台中最成熟、使用最广泛的一款。MinION是一款功能强大的手持测序仪,能够提供具有经济效益的,实时长读长测序数据。体积小到可以放到口袋里。带有512个有效通道,数据量高达30Gb,USB驱动可以在广泛的应用领域帮助研究者快速研究生物学。这款是适合很多实验室的入门选择。
2. GridION:可运行高达5张MinION芯片或Flongle芯片,GridION上一次可有多达2560个有效通道进行测序。可以简单理解为5个MiniION在加一台高性能服务器,内置一些软件。如果做大型基因组相关分析,每次需要产出较多数据量,可以选择GridION。
3. PromethION:PromethION是灵活、高产量的台式测序仪,是大型项目和高通量实验室的理想选择。可以同时或单独运行多达24个(PromethION 24)或48个(PromethION 48)测序芯片——根据需求可提供高达Tb级别的长读长测序数据。集成的高性能计算能力可实时进行碱基识别和后续分析,以便快速获得结果。单张测序芯片内部最高通量220Gb,用户手中最高通量180Gb。我们已经在P48的单次测序运行中获得了超过7Tb数据。PromethION 48每年可运行4500张测序芯片。现在已有多项使用PromethION开展的大型项目:人类X染色体、100天测序100个番茄基因组、10万人的结构变异分析。PromethION是目前的旗舰产品,旗舰产品必须配有旗舰机的价格。
4. Flongle:是MinION和GridION的转换器,Flongle芯片可以随时随地进行快速、小型的测试,并已经在人们希望得到快速答案得小型实验中显示出价值。单张芯片数据产出为1.8G。Flongle设计用于更小或者更频繁的测试及实验的最快速可得和最具经济效益的测序系统。可以用于微生物测序或者肿瘤panel数据,带有126个通道的测序芯片耗材。
技术优势
1. 超长读长:在纳米孔测序中,读长长度可以等于输入片段长度。读长长度不受限于测序设备,用户可以通过所使用的文库制备实验方案来控制片段长度。目前报到处DNA片段长度最高记录为>2 Mb,直接RNA测序读长最长为26kb。长读长提供了一个更明确的方法来比对和匹配DNA或RNA序列,提供高质量、更完整、更连续的基因组组装。在类如植物基因组和具有大型结构变异和高水平重复区域的基因组中优势显著。
2. 直接测序:纳米孔技术基于电子学原理,允许直接测序原始DNA和RNA。不需要通过DNA拷贝、进行链合成或使用亚硝酸盐进行转化,这不仅节省了时间和成本,还意味着碱基修饰的信息会被完整的保留,并且包含在测序运行产生的原始信号信息中,随时进行分析。由于纳米孔技术支持无需PCR的直接测序,也就没有了扩增偏好性,并且文库制备工作流程也更简单。
3. 实时测序:与在运行结束时批量交付数据的传统测序技术不同,纳米孔技术提供的是动态、实时的测序,支持在几分钟内就获得病原体鉴定等时间关键型应用的检测结果。测序时,DNA快速通过纳米孔。DNA片段通过纳米孔的速率已从推出时的每秒35个碱基提升到了现在每秒450个碱基。每一个在阵列上完成的读长,在数秒后就可以用来开始数据分析,而不是几小时甚至几天。用户可以在测序早期了解样本的质量和状态,也可以在获得足够的数据后停止测序。快速的采样到结果周转时间在未来感染性疾病、实地动态监测疫情爆发以及其它诊断方面具有巨大潜力。
4. 按需要测序:与传统测序技术不同的是,在纳米孔测序中,用户可以自行掌握测序时间、地点、以及需要使用的芯片数量。例如,可以单次使用的最小型的测序芯片Flongle适合快速质量检测、小型基因组实验和靶向测序。便携式测序仪MinION,重量不足100g,可以被带到任何地方测序任何样本。台式测序仪GridION和PromethION分别具有5个和24或者48个测序芯片,每个芯片可以独立运行,也可以同时使用,并结合实时的数据传送。这意味着用户可以根据样本的数量选择芯片数量,随数据量要求随时启动和停止实验。
5. 启动费用低:传统的高通量测序价格昂贵,启动需要数十万至百万人民币。而纳米孔测序目前启动套装只需要1万多元,包括MinION测序仪,两张测序芯片,一盒建库试剂盒,一盒清洗试剂盒。两张芯片最多可以测序60G数据。
6. 灵活、可扩展:所有Oxford Nanopore测序设备使用同样的核心技术,用户可以轻松根据应用测试实验以及扩大或缩小规模。从最小型的Flongle和掌上MinION,到桌面型的GridION和PromethION。所有设备都可用于进行按需测序实验。包括从单次试验到超高通量项目,全部都可提供快速、长读长、实时的DNA或RNA直接测序。用于纳米孔测序的DNA或RNA建库过程简单直接,最快的建库方法只需5到10分钟就可在样本分子末端添加测序接头及马达蛋白。
应用领域
1. 大基因组拼:Nanopore最显著特点就是读长长。长读长对于大基因组的拼接将会产生立竿见影的效果。在以往基于短片段的基因组拼接中,由于一些动植物基因组本身具有多倍体,高度重复,高度杂合的特性,导致基因组拼接是一项异常艰难的工作,有些植物甚至复杂到利用短片段根本无法完成拼接工作,例如基因组大小高达152Gb的重楼百合(Paris japonica),还有10倍体的择捉草莓(Fragaria turupensis)等。虽然有大片段文库,BAC文库、optical mapping光学图谱、Hi-C、bionano等辅助技术,但依然无法从根本上解决大型基因组拼接的问题。而nanopore测序技术将从根本上改变大型基因组拼接技术难题。利用三代测序可以极大的提高基因组的完整性contig数目减少,N50长度可以达到M级别,同时配合多轮纠错机制,拼接的准确性也非常高。
2. 细菌完成图:由于细菌基因组比较小,通常小于10M,大部分是一条染色体,并且由于细菌基因组通常重复序列不多,利用nanopore的长读长的特性,甚至可以一次性拼接出完整的基因组。
3. 全长无偏倚转录组:以往的转录组分析,由于无法直接对RNA进行测序,往往需要先对mRNA进行打断,在反转录为cDNA。反转录过程中PCR可能会引入扩增偏差,导致筛选到假阳性的表达差异基因,尽管目前采用单细胞加UMI特异标签的方法减少PCR偏差。但依然无法获取和分析全长转录本,由于真核生物普遍存在的剪切差异,短读长测序依然无法准确识别,而利用nanopore的长读长测序,可以准确识别各基因的多个同源异构体,简单准确。并且nanopore可以对RNA直接测序,这样就能够直接识别RNA的碱基修饰。
4. 大片段结构变异:目前的基因组突变分析主要在单碱基突变SNP,以及少量的插入缺失(InDel)上,而忽略掉基因组上含量巨大的大的结构变异。这主要是因为仅使用短测序读长时,无法准确检测这些变异,例如缺失、插入、重复、倒位和易位。但已有研究表明,这些重复区域和结构变异与人类的健康和疾病有关(例如,老龄化、三联体扩张疾病、自闭症、癫痫和癌症),使得对它们进行的常规表征鉴定非常有利。利用nanopore长读长的特点,非常适合进行大片段结构变异的检测。
5. 突变定相分析:所谓定相分析,被称为Phasing,简单来说就是将一个二倍体(甚至是多倍体)基因组上的等位基因信息,判断出其遗传自父本还是母本,最终使得所有来自同一个亲本的信息都能够排列在同一条染色体里面。很显然,测序的长度越长对定相分析越有利(如果是完整一条就直接比对就行了)。根据文献报道,利用超长读长不仅使组装连续性提高了一倍(NG50-6.4MB),而且显著改善了定相(phasing)等位基因的功能。例如,有可能对包含在单个16 MB contig中的整个4 MB主要组织相容性复合体(MHC)进行定相(phasing)。
6. 微生物快速鉴定:利用nanopore测序,实时,快速的特点,非常适合为微生物的快速鉴定。可以在采集点分析直接进行测序,而且实时的basecalling,上机几分钟之后就可以有序列产出,可以直接使用序列进行物种分类鉴定。从样本到检测结果用时大大减少。据报道,使用MinION在北极环境中从样本采集到测序数据生成仅需不到40小时。