全长转录本测序基于单分子实时测序Pacbio平台，无需打断拼接，超长读长可获得mRNA全长序列及完整结构信息，从而准确分析有参考基因组物种可变剪接及融合基因等结构信息，克服无参考基因组物种转录本拼接较短、信息不完整的难题。同时还可以借助二代测序数据，进行转录本特异性表达分析，获得更加全面的注释信息。

全长有参转录组：对于有参考基因组的物种，利用三代全长转录组测序获得的信息是生物体内直接存在的，比基于参考基因组预测到的转录组信息更准确，也可准确鉴定基因的可变剪接、融合基因、基因家族及非编码RNA等信息。此外，基于全长转录组数据，可优化基因结构，进而辅助基因组组装和注释。

全长无参转录组：由于基因组测序成本高，缺乏基因组参考信息在很大程度上限制了对物种的深入研究。通过三代全长转录组测序来构建物种Unigene库，无需进行序列组装，就可获得该物种转录组水平的全长转录本信息，更准确地进行CDS和SSR分析，为后续研究提供遗传信息基础。

样品要求

      技术优势

无需进行转录本的拼接便可直接获得全长转录本序列，能够更真实地反映测序物种的转录组信息；通过检测多种可变剪接形式，可发现更多的剪接位点和可变剪接事件；能够发现新的功能基因，补充基因组注释；有助于融合基因、同源基因、超家族基因或等位基因的精确分析。

Q1. 为什么全长转录组推荐“三+二”测序？

答：目前已报道全长转录组文章大多采用“三+二”的模式，三代建库测序以检测更准确的结构变异为主，对于有参考基因组物种可以准确检测可变剪切，融合基因，新基因的预测，对于无参考基因组物种提供准确的参考序列，有助于后期差异分析；二代测序转录组研究可以实现较三代更准确的定量。此外“三+二”模式可以利用二代的数据对三代进行校正。

Q2. 全长转录组测序如何取样？

答：需根据研究目的而定。通常情况下，若想获得某物种比较全面的转录本信息，建议采集不同组织样本提取RNA，等量混合测序，得到尽可能全面的表达转录本。如植物，建议取根、茎、叶、花、果实等；如动物，建议取肝脏、肾脏、肠、皮肤等部位；若只针对某个组织部位进行组织特异性全长转录组分析，则可只对该组织取样，也可以取该组织不同的发育时期样品提取RNA，等量混合分析。

Q3. 全长转录组测序中，为什么要建3个以上文库？

答：全长转录组采用单分子实时测序技术，通过构建哑铃型文库，以环形方式循环测序。测序时，短片段文库更容易落入零模波导孔。为了避免测序过程中短片段文库偏好性，保证不同长度转录本的覆盖度，因此会构建3个或3个以上文库。

Q4. 如何选择全长转录组测序数据量？

答：基于PacBio Sequel平台，如果是想获得转录组中高表达基因，可选择1个文库测1-3个Cell（5-15 G数据），如果想获得更多极低丰度基因，建议1个文库测3个Cell以上。同时，也需要参考研究物种转录组复杂性，如多倍体物种，基因数量一般相对较多，在参考上述情况后，需适量增加数据量。

文章：Physiological Characteristic Changes And Full-Length Transcriptome Of Rose (Rosa Chinensis) Roots And Leaves In Response To Drought Stress

期刊：《Plant and Cell Physiology》

影响因子：4.924

研究背景

气候变化导致的温度升高和水资源匮乏已成为一个亟待解决的全球性难题，干旱或缺水是植物经常面临的逆境条件之一，严重威胁着植物的生存和制约着植物生产力的提高。植物的根系和叶片是调节水分在土壤和水分之间流动的最重要器官，缺水时，根系结构会发生形态学改变以增强其吸水能力来应对干旱胁迫，叶片则可以通过气孔关闭等策略来减少水分的过度流失，但就目前而言，根系和叶片对干旱胁迫响应的分子机制尚不清楚。玫瑰是具有很高观赏价值和经济价值的园艺作物之一，多生长在温暖湿润的亚热带气候区，在栽培期和长发育过程中，玫瑰易受水分缺失的影响，加之花卉本身的脆弱性，进而对花卉造成很大的损害。此前对玫瑰花瓣的转录组分析已经确定了对疾病响应、盐度和热胁迫以及与花色相关的基因。然而，玫瑰植株对干旱胁迫的分子响应机制仍有待进一步阐明。

研究方法

首先，以2月龄玫瑰幼苗为材料，在不干旱（ND，干旱处理0天）、轻度干旱（MD，5天）和重度干旱（SD，10天）胁迫条件下，对其相对含水量和光合特性进行了分析。其次，为了阐明干旱响应的分子机制，对不同处理植株的叶（L）和根（R）进行了全长RNA-Seq、功能注释、差异表达基因（DEGs）的比较分析及 GO 和KEGG富集分析。最后，检测脱落酸（ABA）和生长素的含量和鉴定TFs、LncRNA以及可变剪接异构体。

研究结果

本文中，作者分析了干旱引起的玫瑰幼苗叶片和根部光合作用和激素水平的变化，首次在MD和SD条件下建立了全长玫瑰转录组。结果显示，与其他两组相比，MD处理显著提高了玫瑰叶片的叶绿素含量和水分利用效率。MD和SD组叶片分别鉴定出580和3,326个DEGs，而与其对应的根部样品分别鉴定出3,445和1,751个DEGs，这表明干旱响应的转录机制在根中占主导地位。KEGG信号途径分析显示调控碳代谢、植物激素合成和信号转导的基因受到干旱胁迫的影响，可能在叶片和根的适应反应中发挥关键作用。此外，还鉴定了组织特异性的干旱响应基因、TFs、lncRNA和AS。鉴定出特定组织在不同干旱条件下参与光合作用，ABA和生长素生物合成和信号传导的基因模块，本研究为未来玫瑰植物抗旱性的机理和功能研究奠定了基础。