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案例解读

宏转录组（Metatranscriptome）测序是指从整体水平上研究某一特定环境，特定时期群体生命所有基因组转录情况以及转录调控规律的研究手段，它研究对象是微生物组mRNA，在获取总RNA后去除rRNA，反转录为cDNA，构建合适长度的插入片段文库，对这些文库进行双端（PE）测序，从而能精确定量整个菌群中具有活性的物种精细组成及其对应功能的表达水平，进而锁定菌群中的关键生物标记物、阐明其生物学意义。相较于宏基因组，宏转录组能从转录水平研究复杂微生物群落变化，能更好的挖掘潜在的新基因，已广泛应用于肠道内容物、土壤及水体等研究中。

送样要求

样品类型	要求
动物	粪便、昆虫肠道：5-10 g；唾液、痰液：15-20 mL；血液：5 mL；尿液：30 mL；瘤胃液(内容物)：60-80 mL；口腔/皮肤棉试子：每个样本采集3-4个试子；小鼠肺泡灌洗液20-30 mL；
环境	水体样本：10-15张滤膜（滤膜直径3-5 cm）；土壤、根际土壤、活性污泥及沉淀物：5-10 g；植物内生菌：1.5-3 g；叶片表面菌、空气：15张滤膜；
其他	发酵液：60-80 mL；颗粒填料：15张滤膜；
RNA样本	RNA浓度 ≥65 ng/μL（Qubit）、RNA质量≥6 μg（Qubit）、RIN≥7.0；28S/18S≥1.0
注意事项： RNA易降解，取样时所用材料尽可能无RNA酶处理

技术优势

专业、高效的总RNA提取技术和rRNA去除技术；利用高通量测序平台，通量高、周期短，真正实现对活性物种和表达功能的精确定量；可根据研究的实际需求选择KEGG/EggNOG/CAZy/NR/Swiss-Prot/GO/VFDB/CARD等数据库多种功能注释数据库，优化宏转录组的活性功能代谢谱注释；通过微生物基因信息精确识别物种来源，获取种以及种以下水平的“高分辨率”活性物种精细组成谱；通过多种多变量统计分析和机器学习方法，系统、深入地挖掘宏转录组大数据中差异相关的活性物种和对应功能，从而精确识别关键的活性生物标记物。

Q1. RNA提取的注意事项？

答：1）样本要尽可能的新鲜，避免反复冻融；

2）针对不同类型的样品选择合适的提取方法；

3）提取过程中注意对RNase的防护穿好实验服、戴好口罩和手套，并勤换手套；

4）提取用枪头和离心管等消耗品均要使用RNase产品，所有提取试剂需用0.1% DEPC处理过过夜后高温灭菌30 min才能使用或购买RNase free试剂；

5）提取时组织要充分研磨，组织量不宜过少，更不宜过多；

6）加入裂解液后应给予充分的孵育时间，使样本充分裂解；

7）在用Trizol法提取时，分层后吸取上清的原则是“宁愿少吸，不能多吸”，千万不能提取到中间层，否则会导致严重的基因组DNA污染；

8）洗涤时洗涤液应充分浸润到管壁的四周，确保洗涤彻底；

9）柱式提取法，洗涤完后除了对柱子进行空离后，还应当将吸附柱置于超净台内吹风5-10 min，使有机溶剂充分挥发干；

10）柱式法最后洗脱时候，当加入DEPC水后还应孵育3-5 min，或者提前将DEPC水加热至60 ℃，可提高洗脱得率。传统的Trizol裂解异丙醇沉淀法最后RNA是用DEPC水溶解沉淀，则应当给予适当溶解时间，并用枪头不断吹吸离心管底部；

11）异丙醇、氯仿、乙醇等试剂要使用未开封的，或者开封之后直接分装至小容量离心管的，以避免多次使用的交叉污染。

Q2. 宏转录组与宏基因组有何区别？

答：宏基因组是以环境中所有微生物的DNA为研究对象，宏转录组以环境中所有微生物的RNA为研究对象，宏基因组告诉我们环境中所有微生物能够做什么，而宏转录组告诉我们环境中所有微生物正在做什么。

Q3. 宏转录组一般推荐多少数据量？

答：项目具体需要多少数据量，需根据研究目的来进行选择，一般推荐10G数据量。

文章：Metatranscriptome-based investigation of flavor-producing core microbiota in different fermentation stages of dajiang, a traditional fermented soybean paste of Northeast China

期刊：《Food Chemistry》

影响因子：7.514

研究背景

大酱是东北传统制作的自然发酵豆酱，因其独特的风味成为了调味佳品，具有抗癌、抗氧化、抗高血压等作用。大酱的独特风味与发酵过程中的微生物群落密切相关。然而，当前研究主要对发酵过程中微生物产生的代谢物和风味诱导化合物进行探索，缺乏对驱动发酵过程的核心微生物群及其与主要风味代谢物的相关性研究，且主要在DNA层面进行解析，因而无法确定这些微生物是否确实在发酵过程中发挥了作用。宏转录组测序可以针对大酱中的活性微生物群落进行研究，有利于确定在发酵或赋予风味中起关键作用的核心微生物物种，从而揭示相关微生物的群落结构与功能的变化。

研究方法

首先，提取不同发酵阶段（第0天、第14天、第28天、第42天、第56天）大酱样本的微生物组总RNA，并对不同发酵阶段的样本进行宏转录组测序、KEGG代谢数据库及CAZy数据库功能注释，以解析大酱中的活性菌群组成和功能特征。其次，采用顶空固相微萃取（HS-SPME）、气相色谱-质谱（GC-MS）和氨基酸分析，检测整个发酵过程中生化指标和风味成分的变化。最后，通过微生物组、生化指标、风味成分的联合分析，去确定大酱发酵过程中香味产生的作用机理和关键的微生物群落。

研究结果

大酱中活性菌群结构分析显示，豆酱中的优势微生物主要属于厚壁菌门，主要属为四联球菌和乳杆菌。进一步分析大酱中活性微生物与理化特性和风味物质之间的相关性，结果也显示，乳杆菌属和四联球菌属是影响色泽和风味的核心属，它们产生的酶催化一系列代谢途径，从而产生风味物质。此外，还鉴定出10种有助于大豆酱风味形成的挥发性化合物。本研究的发现为菌群在发酵食品风味形成中的作用提供了新的见解。