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微生物多样性测序又名扩增子测序，是基于二代高通量技术对环境样品中DNA特定长度的PCR产物进行测序。细菌（16S rRNA）、真核（18S）、真菌（ITS）以及功能基因等基因的扩增子测序能同时对优势物种、稀有物种及一些未知物种进行检测，精准解析微生物在种属水平上的组成和丰度情况，是当前对环境微生物多样性及群落组成差异研究的重要技术手段。根据不同的研究目的和需求，微生物多样性测序可以细分为以下四个产品：

产品类型	特点	常用区域
16S rDNA测序	为编码原核生物核糖体小亚基rRNA的DNA序列，主要进行细菌或古菌的多样性分析	V4、V3-V4、V4-V5
18S rDNA测序	为编码真核生物核糖体小亚基rRNA的DNA序列，反映样品中真核生物之间的种类差异	V4
ITS测序	主要对环境微生物中的真菌多样性进行分析，用于真菌类群的物种鉴定和群落组成分析	ITS1、ITS2
功能基因	根据研究的实际需求需求，基于功能基因/持家基因/靶基因等对特定基因的PCR产物进行测序，只需保证PCR产物≤500 bp即可	AOA、AOB、nxrA

常用引物

测序类型	引物名称	引物序列
细菌16S rRNA	515F	5'-GTGCCAGCMGCCGCGG-3'
细菌16S rRNA	907R	5'-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3'
细菌16S rRNA	515F	5'-GTGCCAGCMGCCGCGG-3'
细菌16S rRNA	806R	5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'
细菌16S rRNA	799F	5'-AACMGGATTAGATACCCKG-3'
细菌16S rRNA	1115R	5'-AGGGTTGCGCTCGTTG-3'
细菌16S rRNA	341F	5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3'
细菌16S rRNA	806R	5'-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3'
真菌ITS	ITS1F	5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'
真菌ITS	ITS2R	5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'
真菌ITS	ITS3F	5'-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3'
	TIS4R	5'-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3'
	TIS4R	5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'
真核18S	1380F	5'-CCCTGCCHTTTGTACACAC-3'
真核18S	1510R	5'-CCTTCYGCAGGTTCACCTAC-3'
真核18S	TAReuk454FWD1	5'-CCAGCASCYGCGGTAATTCC-3'
真核18S	TAReukREV3	5'-ACTTTCGTTCTTGATYRA-3'
古菌	Arch519F	5'-CAGCCGCCGCGGTAA-3'
古菌	Arch915R	5'-GTGCTCCCCCGCCAATTCCT-3'
固氮菌	NifH1F	5'-TGYGAYCCNAARGCNGA-3'
固氮菌	NifH2R	5'-ADNGCCATCATYTCNCC-3'
反硝化细菌	Cd3aF	5'-GTSAACGTSAAGGARACSGG-3'
反硝化细菌	R3cd	5'-GASTTCGGRTGSGTCTTGA-3'

样本要求

样品类型	样品总量	项目周期
环境样本	土壤≧5 g	16S、18S、ITS测序及分析需25个工作日，功能基因扩增子测序需30个工作日。
	粪便≧2 g
	水体样本：一张直径 3-5 cm的滤膜，滤膜上可见附着物
DNA样品	DNA总量≧500 ng，DNA电泳条带清晰，无降解或者轻度降解
	DNA浓度≧20 ng/uL，无明显降解
均需使用干冰或冰袋运送

实验流程

微生物组总DNA的提取→目标片段的PCR扩增→扩增产物的检测定量→测序文库的制备→MiSeq上机测序

Q1. 微生物16S多样性测序的应用领域？

答：环境微生物多样性测序应用领域非常广泛。1）医药方面：疾病诊断、疾病机理、药效评价及药物机理；2）环境生态学方面：环境微生物差异研究和生物地理学研究；3）植物科学方面：植物保护、连作障碍、作物生长与根际微生物关系；4）动物科学方面：动物肠道微生物研究；5）工业应用方面：污水处理、油污利用及酿酒微生物研究；此外，还有某些重要次生代谢物相关的环境微生物多样性研究。

Q2. 微生物多样性数据能否注释到种吗？

答：16S信息分析流程使用比对的方法进行序列的注释，简单来说，当一条未知序列与某一条参考序列的相似性高于某一阈值时，才能把这条序列归为参考序列这一类。因此，能否将结果注释到种水平取决于：该类微生物本身在数据库中是否可以区分到种水平；扩增区域是否足够特异或足够长，能支持分析方法鉴定到种水平。

Q3. 微生物多样性中OTU是指什么？

答：OTU（Operational Taxonomic Unit ）即分类操作单元，是在系统发生学研究或群体遗传学研究中，为了便于进行分析，人为给某一个分类单元（品系、种、属、分组等）设置的同一标志。在微生物多样性分析中，根据不同的相似度水平，对所有序列进行OTU划分，一般情况下，如果序列之间的相似性大于97% （种水平）就可以把它定义为一个OTU，每个OTU代表一个物种。

Q4. β多样性分析中四种距离算法有何差异？

答：binary jaccard、 bray curtis、 unweighted Unifrac（限细菌）及weighted Unifrac （限细菌）四种算法是β多样性分析主要采用的方法，用于计算样品间的距离，它们的区别见下表：

基于独立OTU

基于系统发生树

加权

（同时考虑物种有无和物种丰度）

bray curtis

weighted Unifrac

非加权

（主要考虑物种的有无）

binary jaccard

unweighted Unifrac

文章：The Behavior of Amphibians Shapes Their Symbiotic Microbiomes

期刊：《mSystems》

影响因子：6.633

研究背景

青蛙属于两栖动物，既可生活在陆地上，也能生活在水中。两栖动物作为变温动物，对外界环境的变化非常敏感，当气温上升时，两栖类动物会迁移到池塘或湿地进行繁殖，以确保其后代的生存。当温度下降时，它们会迁移到适合冬眠的地方，以维持它们在寒冷季节的体温。此外，两栖动物皮肤微生物对温度和湿度等环境变化敏感，且肠道微生物群会也随着环境改化而变化。研究发现，两栖动物的共生微生物季节动态主要是由食物（肠道微生物组）或生活环境（皮肤微生物组）变化所致，然而大多数两栖动物的微生物组研究主要集中在皮肤上，体内微生物组的结构和动态研究较少。

研究方法

了解宿主行为与微生物组动力学之间的相互作用是微生物生态学领域的首要任务。为此，作者探讨了野生两栖动物的行为和生活环境是如何影响它们外部（皮肤）和内部（胃和肠道）的共生微生物群，分别于5月（潮湿的稻田）和10月（干旱的稻田和蔬菜地）采集4种野生蛙类（Bufo gargarizans、Fejervarya limnocharis、Pelophylax nigromaculatus及Microhyla fifissipes）的皮肤样品和胃肠道内容物样品以及水样和土壤样品，并基于16S rRNA基因的序列进行α多样性分析、β多样性分析、微生物组传播溯源分析以及蛙类皮肤样本可疑病原体分析来阐述4种野生蛙类在水栖和陆地生活时其皮肤、胃和肠道上的共生微生物的差异。

研究结果

本研究分别在5月和10月调查了4种不同科野生蛙类的皮肤、胃和肠道三种共生微生物的季节动态。结果显示，5月份的青蛙体内的水源微生物比10月份多。相反，10月份土壤源微生物数量高于5月份。被调查的蛙种倾向于在5月份生活在水环境中，而在10月它们更喜欢生活在陆地上。因此，野生两栖动物共生微生物群落的季节性变化可能是由于其生存环境中微生物传播的差异所致，即野生两栖动物的行为和生活环境塑造了它们外部（皮肤）和内部（胃和肠道）的共生微生物群落，这表明全球环境的变化可能影响野生动物共生微生物群落的发展。