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转录组（Transcriptome）是连接基因组遗传信息与生物功能的必然纽带，在广义上是指细胞内全部转录产物的集合，狭义上是指细胞中所有转录本（mRNA）的集合。根据实验样品的不同，常规转录组测序可分为真核生物转录组测序和原核生物转录组测序；根据测序物种有无参考基因组，可以分为有参基因组转录组测序和无参基因组转录组测序。当前，转录组测序产品包括：真核/原核生物转录组测序、LncRNA测序、Small RNA测序、CircRNA测序以及全长转录组测序。我们将针对mRNA的RNA-Seq测序称为转录组测序，即利用第二代高通量测序技术进行cDNA测序，全面快速地获取某一物种特定器官或组织在某一状态下的几乎所有转录本。

一、真核生物转录组测序

真核生物转录组测序以高通量测序为基础，可全面快速地获得某一物种特定细胞或组织在某一状态下的所有转录本的集合，用于研究基因结构和基因功能、可变剪接和新转录本预测等。真核有参转录组测序是对真核生物特定组织或细胞在某个特定状态下转录的所有mRNA进行测序，与参考基因组比对，既可全面快速分析mRNA序列和丰度信息、又可对基因结构和产生的新转录本进行分析。真核无参转录组测序是对真核生物特定组织或细胞在某个特定状态下转录的所有RNA进行测序。

样品要求

样品类型	要求
总RNA	完整且无污染的RNA样品，总RNA≥1μg （单次200 ng），浓度≥ 50 ng/uL，OD₂₆₀/OD₂₈₀在1.8-2.2之间，OD₂₆₀/OD₂₃₀在1.8-2.2之间，RIN≥7.0，28S/18S≥1.5。样品切忌反复冻融，用封口膜将样品管密封，防止污染，用干冰运输到实验室。
组织样品	动物、植物、微生物总量大于300 mg的新鲜组织（植物材料应尽量选取幼嫩部位）。采样后将样品立即用TRIZOL或RNAlater或液氮速冻，分装保存于-80℃(保存期不超过一个月)，封口膜将管口密封，干冰运输至实验室(不超过48 h)。
细胞样品	细胞个数≥ 110⁷个。先使用TRIZOL试剂进行处理，每0.25 mL样品(5-1010⁶个细胞)加入0.75 mL TRIZOL试剂(可参考试剂说明书)，分装保存于-80℃(保存期不超过一个月)，封口膜将管口密封，干冰运输至实验室(不超过48 h)。

二、原核生物转录组测序

原核生物转录组测序是基于Novaseq平台，构建链特异性文库，研究原核生物在某个时期或者在某种环境条件下转录出来的所有mRNA。由于原核生物mRNA没有polyA尾结构，需要采用去除rRNA的方法构建文库，以保证数据质量。

样品类型	RNA
样品总量	≥10 μg
样品浓度	≥200 ng/uL
样品纯度	OD₂₆₀/OD₂₈₀在1.8-2.2之间，OD₂₆₀/OD₂₃₀在1.8-2.2之间，RIN≥7.0，核酸完整无降解
项目周期	45个工作日

Q1. RNA降解对mRNA测序有什么影响？

答：若RNA的3’端发生降解，则无法通过3’端的poly(A)捕获mRNA，反转录不能得到全长cDNA；若5’端发生降解，通过3’端poly(A)捕获到的mRNA，其测序结果将会出现明显的3’和5’偏向性。

Q2. 与基因芯片相比，转录组测序有和优势？

答：基因芯片是用已知序列的探针和样本mRNA进行杂交来获得mRNA的序列信息，只能检测已知mRNA，无法发现新的mRNA；转录组是直接对样本mRNA进行测序，能够发现新的mRNA。转录组测序对基因表达上调或下调的检测灵敏度高得多。在有参考基因组的基础上，通过转录组测序可进行可变剪切，基因结构变异，全基因组水平基因表达丰度等诸多分析。

Q3. 在做真菌转录组时，霉菌（比如灰霉菌、青霉菌）提取RNA需要多少量？

答：霉菌分为菌丝体和孢子体两种形态，对于菌丝体而言，9 cm左右的培养皿，长到该皿2/3大小的时候，收取2-3皿菌丝，一次提取用量为干重量50 mg-100 mg。

Q4. 如何对得到的数目较多的差异基因进行后期验证？

答：首先根据GO或者KEGG富集结果，或者客户关注的基因，选取有代表性的进行qRT-RCR验证。然后根据RPKM值，选择RPKM值差异倍数答，同时p值小的基因进行qRT-RCR验证。

Q5. 转录组测序需要多少数据量？

答：转录组测序所需的数据量依据物种转录组大小的不同而有所差异。针对有参转录组，可通过分析基因组信息，统计编码基因的个数及碱基数评估转录组的大小，同时参阅相关的文献，进而确定具体数据量；针对无参转录组，则参考相近物种的转录组大小以确定数据量。总之，基因组越大，则所需数据量越大，对于绝大多数动植物来说6G的数据可以进行常规的生信分析。但若要研究低丰度的转录本或想拼出一套比较完整的转录组，建议10G。

Q6. 物种没有参考基因组，能否进行原核转录组分析？

答：不可以进行原核转录组分析，因为原核生物的mRNA一般为多顺反子，直接拼接效果较差，原核转录组要求有参考基因组。

Q7. 原核转录组为什么要构建链特异性文库?

答：原核生物不具有polyA的结构，无法通过polyA的方式建库，只能通过Total RNA的建库方式，但是Total RNA中rRNA的比例很高，所以得先去除rRNA，再进行建库。此外，原核生物的基因组较小，且存在大量基因重叠区域、操纵子及多顺反子，其数据分析难度远高于真核。若采用普通建库方式，再定量时准确度会很低。与普通的转录组文库相比，链特异性文库则可以在建库过程中将反向互补序列的文库直接消化掉，不仅保留了原始的mRNA的方向，也提高了定量的准确性，且能很好地区分来源于基因组正链和负链转录本，并进行TSS和TTS预测，所以需要采用链特异性文库进行测序。

Q8. 原核转录组可以做sRNA的分析吗？

答：原核转录组除了可以进行基因表达水平分析以外，还可以进行基因结构、UTR、反义转录本以及sRNA分析。细菌中，长度在50-500 nt的非编码RNA通常定义为小RNA（sRNA），通过Blastx与Nr库作比对，对新预测的转录本区域进行注释，将注释不上的转录本作为候选的非编码sRNA，通过RNAfold软件和IntaRNA软件对候选的sRNA分别进行二级结构预测和靶基因预测。

文章：New insight into the molecular basis of chromium exposure of Litopenaeus vannamei by transcriptome analysis

期刊：《Marine Pollution Bulletin》

影响因子：4.049

研究背景

凡纳滨对虾是世界上养殖最广泛的甲壳类动物，肝胰腺是甲壳动物重要的组成部分，被认为是重金属中毒的关键靶器官。Cr是一种毒性很大的重金属，被广泛应用于电镀、颜料等多种化工生产中，由于含Cr废弃物的大量排放，空气、土壤和水都不同程度地受到了污染。此外，研究发现，Cr可以影响草虾、罗非鱼、蟹、鲶鱼等海洋动物的代谢，在集约化养殖中，凡纳滨对虾组织中Cr的浓度已超过了国家标准，与Cr、Co、Cd、Cu、Fe、Mn、Zn等重金属相比，成为人类健康的首要威胁。然而，有关重金属对水生生物毒性效应的研究较少，其分子毒性机制尚不清楚。

研究方法

为深入了解Cr对凡纳滨对虾毒性作用的分子机制，作者利用RNA-seq技术对虾的肝胰腺进行转录组测序，将对照组样本和铬（Cr）暴露组样本（暴露48 h）进行比较，探究Cr暴露下凡纳滨对虾肝胰腺基因表达的差异。具体包括：利用光学显微镜进行肝胰腺形态学观察；GO、COG、KEGG数据库功能注释、差异表达基因（DEGs）鉴定及GO富集分析；KEGG生物学通路分类分析；DEGs的qRT-PCR验证。

研究结果

与对照组相比，凡纳滨对虾的肝胰腺暴露于Cr后，B细胞数量显著增加，该细胞的增加可能是由于Cr暴露后肝胰腺消化酶活性增加代偿代谢所致。凡纳滨对虾肝胰腺对Cr胁迫的分子机制可能与营养消化、吸收、代谢、化学致癌作用、ABC转运蛋白、溶酶体、过氧化物酶体以及细胞凋亡途径的基因调控有关。凡纳滨对虾潜在的Cr解毒机制可能与肝胰腺基因在蛋白消化吸收途径、化学致癌、ABC转运蛋白和细胞凋亡中的调控有关。Cr毒性机制可能与肝胰腺基因在胰液分泌途径、溶酶体、过氧化物酶体中的调控有关。利用qRT-PCR对RNA-Seq中的6个DEGs进行验证，发现所选基因的表达水平与RNA-Seq结果一致，说明RNA-Seq结果可靠。