小RNA 是存在于生物体内的一类高度保守的RNAs，序列长度一般在18-32 nt 之间，主要包括了微小RNA（miRNA）、小干扰RNA（siRNA）、核仁小RNA（snoRNA）及能与piwi 蛋白互作的piRNA 等。它们在基因表达调控、生物个体发育、代谢及疾病的发生等生理过程中起着重要的作用。小RNA 测序采用高通量技术，可研究某一物种特定组织在特定状态下的所有已知Small RNA，也可发现新的或该物种特有的 Small RNA 并预测其靶基因，为研究 Small RNA 的功能及此物种的基因调控机制提供了有力工具，已广泛应用于动植物的研究和医学领域。

样品要求

技术优势

检测结果全面：可一次性得到上百万条的小RNA序列信息，包括已知的小RNA和未知小RNA，提供极大的数据深度和覆盖率；分辨率高：可以从单碱基水平上对小RNA进行研究，便于分辨序列相似的小RNA且可以避免由芯片法带来的背景噪音；检测任意物种：基于高通量测序平台，无需预先知晓物种小RNA基因的序列信息和二级结构，可直接对其进行深入全面的分析。

Q1. 动植物在miRNA预测中有何差别？

答：植物miRNA可与mRNA的编码区完全互补配对，并通过诱导mRNA降解而发挥抑制表达的作用，我们可以直接通过比对来筛选靶基因，动物miRNA则可与mRNA的3’UTR区部分互补配对结合，进而抑制翻译的进行，一般地，miRNA与mRNA的配对区域位于miRNA的5’端的 2-8个碱基，称为种子区，只要种子区能与mRNA互补配对即可发挥作用，这也是一个miNRA能够调控数百条mRNA的原因。对于动物预测靶基因我们不是直接通过比对进行筛选的。在动物预测时，由于我们没法给出3‘utr区，因此我们截取mRNA5’端前2000 bp使用动物预测靶基因方法进行预测，target_length指的就是我们截取该基因的长度。

Q2. 目前对于小RNA靶基因的结果验证方法有哪些？

答：RT-PCR对miRNA进行定量验证；miRNA过表达；荧光素酶法，过表达miRNA测定靶基因表达量；把靶基因连上一个荧光素酶，如果靶基因表达量下降，可检测到的荧光信号则减弱；降解组测序。

Q3. Small RNA测序数据量需要多少？不同的样品测序得到的 reads 数量相差较大，会不会影响分析准确性？

答：Small RNA测序数据量20M reads就可满足需要。由于Small RNA 在不同物种或同物种不同组织、不同发育阶段表达情况都有差异，而用作提取的样本，其细胞数差异通常也很大，因此样品中表达的Small RNA 总量不可能完全一致。另外，Reads 数量与样品上机浓度、样品 GC 含量、样品自身特性相关。所以，不同样品间存在的差异是正常的。Reads数只会影响到数据量，数据量足够分析就可以，不影响准确性。同时，分析时采用 UMI 定量，这样即使 reads 数量相差较大，也不影响分析的准确性。

文章：Construction of miRNA-target networks using microRNA profles of CVB3-infected HeLa cells

期刊：《Scientific Reports》

影响因子：4.011

研究背景

柯萨奇B3病毒（CVB3）是急性和慢性病毒性心肌炎的主要致病原，通过与宿主细胞表面的受体结合而入侵细胞进行复制，导致心肌细胞凋亡、坏死进而发生直接心肌损伤。此外，CVB3还会感染人类的大脑和胰腺，并导致无菌性脑膜炎和胰腺炎。病毒性心肌炎和胰腺炎的主要病理过程是早期直接病毒诱导的细胞病变效应和严重的炎症损伤，其次是宿主免疫反应。MicroRNAs（miRNAs）在调控基因表达、细胞生长、分化及凋亡、生物的生长发育和疾病中发挥重要作用。研究发现发现病毒入侵宿主后，宿主体内的microRNA会通过不同途径影响病毒与宿主的相互作用。然而，CVB3的确切发病机制尚不完全清楚，病毒CVB3感染后的分子机制尚不明确。

研究方法

为了解在CVB3感染期间miRNA的变化，首先利用CVB3侵染海拉细胞系，然后通过小RNA测序研究感染后3 h、6 h和9 h 海拉细胞中特异性miRNA的表达谱。通过GO和KEGG途径分析68个差异表达miRNAs的生物学意义。利用mirDIP和Navigator构建34个已知高差异表达miRNAs与靶点之间的相互作用网络。最后进行qPCR验证。

研究结果

本研究利用小RNA测序技术在CVB3感染的海拉细胞中构建了miRNA表达谱和特异性相互作用网络。研究表明，与细胞分化和转录调控相关的FAM135A、IKZF2、PLAG1、ZNF148、PHC3、LCOR和DYRK1A通过相互作用调控网络被8个miRNA或9个miRNA识别。RT-qPCR结果显示，DYRK1A、FAM135A、PLAG1、ZNF148和PHC3的表达在感染后 3 h、6 h和9 h受到明显抑制，而LCOR的表达没有明显变化，IKZF2的表达随着感染时间的延长而增加。本研究提高了对CVB3感染通过miRNA调节细胞分化和发育致病机制的理解，并为筛选病毒感染细胞中 microRNA 调控靶基因提供了一种新方法。